Visiškas dervos patinimas
Pasverkite 2,0 g tuščio Wang dervos į švarų ir sausą reakcijos mėgintuvėlį, įpilkite 15 ml DMF, kambario temperatūros aktyvinimas 30 min.
Paimkite pirmąją aminorūgštį
Kambario temperatūroje išfiltruokite tirpiklį iš ankstesnio etapo per smėlio šerdį ir įpilkite 1 mmol 5 molinį perteklių C Pirmoji aminorūgštis pabaigoje, 5 molinis perteklius DMAP, 5 molinis perteklius DIC, DMF Atlikite tirpiklio kambario temperatūros reakciją 3 val. Naudoti pasibaigus reakcijai DMF plauti 4 ~ 6 kartus, 5-6 kartus kiekvieną kartą ml. Tada įpilkite atitinkamą kiekį piridino ir acto rūgšties anhidrido tūrio santykiu 1:1 ir reaguokite 30 min. Naudoti pasibaigus reakcijai DMF plauti 4 ~ 6 kartus, 5-6 kartus kiekvieną kartą ml. (poveikis: užblokuokite aktyvius mikrotaškelius ant nereaguojančios tuščios dervos.)
Fmoc Apsauginių grupių išvykimas
Pašalinkite tirpiklį iš ankstesnio etapo filtruodami siurbimu ir įpilkite 10 ml 20% piperidino DMF. Tirpalas pilamas į dervą, N2 Maišykite 10 min. Galiausiai tirpalą filtruokite ir įpilkite 10 ml 20% piperidino DMF tirpalo, N2 Pūskite ir maišykite 5 min. Tada išfiltruokite tirpalą ir pakartokite šią operaciją du kartus. DMF plauti 4 kartus, 2 kartus plauti metanoliu, 5-6 kartus kiekvieną kartą ml.
Ninhidrino pašalinimo poveikio tikrinimas
Išimkite nedidelį kiekį dervos, tris kartus nuplaukite metanoliu, įpilkite ninhidrino, KCN, po vieną lašą fenolio tirpalo, 105–110 laipsnių Kaitinimas 5 min., Tamsiai mėlyna spalva yra teigiama reakcija, rodanti, kad pašalinimas baigtas ir galima atlikti kitą reakcijos žingsnį.; Jei jis bespalvis, tai reiškia, kad apsauginė grupė nebuvo visiškai pašalinta, todėl reikia pakartoti aukščiau aprašytą apsaugos pašalinimo operaciją.
Tada antroji aminorūgštis ir Fmoc Protection grupės pašalinimas
Pasverkite 3 kartus molinį perteklių C Antroji aminorūgštis gale, 3 kartus molinis HBTU perteklius ir 3 kartus molinis HOBT perteklius Į reakcijos mėgintuvėlį įpilkite atitinkamą kiekį DMF Kai tirpalas visiškai ištirps, įpilkite 10 kartų molinį perteklių (gryną) DIEA, kambario temperatūros reakcija 40 min., naudokite DMF plovimą 4–6 kartus, kiekvieną kartą 5–6 kartus. Paimkite nedidelį dervos kiekį Naudokite Išbandykite su ninhidrino aptikimo reagentu ir jis atrodys bespalvis, tada įpilkite 10 ml 20% piperidino DMF tirpalo pašalinimas Fmoc, Atlikite tai du kartus po 10 min., 5 min., po naudojimo DMF Nuplaukite 4 kartus, plaukite 2 kartus metanoliu, 5-6 kartus kas kartą ml. Išimkite nedidelį dervos kiekį, kad jį aptiktumėte, naudokite ninhidrino aptikimo reagentą. Jei aptikimas yra mėlynas, galite pereiti prie kito reakcijos žingsnio.
Analogiškai kartokite 2.6 žingsnius, kol sintezė bus N. Pašalinkite paskutinę aminorūgštį Fmoc Protect bazės gale, tada nusausinkite.
Dervos išsiskyrimas ir gryno produkto atskyrimas bei aptikimas
Galiausiai naudokite trifluoracto rūgšties pjovimo tirpalą (95% TFA:2% TIS:2% EDT:1% H2O) Pjaukite 2 val., Filtruokite reakcijos tirpalą nusiurbdami ir gaukite polipeptido trifluoracto rūgšties tirpalą. Lizatą kiek įmanoma išdžiovinkite azotu, nusodinkite eteriu, centrifuguokite ir 3 sekundes plaukite eteriu. ~5 kartus buvo gauta balta kieta medžiaga. Ištirpinus jį gryname vandenyje, HPLC pašalinkite druską ir išvalykite, užšaldykite{11}}džiovinkite ir nusodinkite kristalus, paimkite nedidelį kiekį MS analizės.